Botanische Mikrotechnik

Vor genau zwei Jahren fand sich über persönliche Bekanntschaften ein Freundeskreis zur botanischen Mikro- technik und wir zeigten uns unsere Schnitte und Färbungen, gaben uns Tipps und stellten Mikroaufnahmen unserer Präparate auf eine eigens dafür geschaffene Webseite.
Den Freundeskreis gibt es noch, die Webseite nicht mehr und so hat mich unser Administrator gebeten, die seinerzeit von mir zusammengestellte Drei- fachfärbung Safranin-Astrablau-Chrysoidin noch einmal zu beschreiben, damit sie für jeden Interessierten zugänglich wird.
Eigentlich ist im Arbeitsplan alles beschrieben: der Färbeprozess mit den not- wendigen Reagenzien und Rezepturen. Doch sollten einige Anmerkungen hierzu den Zugang zur Färbung erleichtern.

Vorgefärbt wird mit Safranin, die Färbezeit ist unkritisch und kann gerade bei dünnen Schnitten (ca. 30 µm und dünner) bis zu 30 Minuten betragen. Es wird somit deutlich und gewollt überfärbt.
Diese Überfärbung differenzieren wir mit Salzsäurealkohol. Der Aufenthalt in dieser Reagenz ist kurz, ungefähr 30 Sekunden bis zu einer Minute. Am besten wird der Fortschritt mit einer Lupe kontrolliert. Wenn keine Farbwolken mehr abgehen wird abgebrochen. Anschließend ist es wichtig, den Schnitt in Wasser sehr gut aus zu waschen. Jetzt haben wir erreicht, dass die lignifizierten Zellwände magentafarbig aussehen, nicht lignifizierte Zellwände sollten annähernd farblos sein.

Mit dem Stereomikroskop kann man im Auflicht wunderbar die Strukturen z.B. eines Blattes untersuchen. Legt man dieses jedoch unter ein klassisches Durchlicht-Mikroskop, so erkennt man bestenfalls verschwommene Umrisse auf einer milchig grünen Fläche. Das Blatt als ganzes ist zu dick, um im Durchlicht betrachtet werden zu können.
Um Erfolg zu haben, müssen also Schnitte von dem Blatt erstellt werden, die dünn genug sind, um genügend Licht für die Beobachtung hindurch zu lassen (max. bis etwa 70µm) und dick genug, um die Zellverbände noch erkennen und deuten zu können (min. bis etwa 7 µm). Die optimale Schnittdicke ist dabei von der Probe abhängig. Histologische Schnitte tierischer und menschlicher Gewebe sind wesentlich dünner (5 µm bis hinunter zu 70 bis 100nm), da die zu beobachteten Zellen entsprechend kleiner sind.

Ein Mikrotom ist ein Gerät zum Erstellen solch dünner Schnitte für mikroskopische Unter- suchungen im Durchlicht. Der Name kommt aus dem Griechischen von "mikros" (klein) und "temnein" (schneiden). Für unterschiedliche Zwecke und Materialien wurden die unterschiedlichsten Mikrotomtypen entwickelt (Ultra-Mikrotom, Rotationsmikrotom, Schlitten- mikrotom, Zylindermikrotom und Kastenmikrotom). Teilweise handelt es sich dabei um sehr aufwendige und entsprechend teuere Geräte, die nur in professionellen Laboren zu finden sind. Andere sind auch an den Arbeitsplätzen der Hobby-Mikroskopiker anzutreffen.

Das Zylindermikrotom schiebt die Probe mittels einer Mikrometerschraube über einen Stempel oder eine Klemmvorrichtung durch das Mittelloch einer Glasplatte, die als Messerführung dient. Der überstehende Teil der Probe kann dann mit einem geeigneten Messer (dazu später mehr) abgeschnitten und weiter präpariert werden.
Je nach Probe, Vorbereitung und Geschick sind Schnittdicken zwischen 70 und etwa 20 µm erreichbar, was für botanische Schnitte in aller Regel ausreichen dünn ist.

Zum Schneiden kann man verschiedene Messer verwenden, die frei geführt werden müssen - die Schnittbahn ist also nicht wie beim Kastenmikrotom fest vorgegeben. Gute Ergebnisse erzielt man mit einem speziell für den Mikrotomschnitt geschliffenen Rasiermesser, das je nach dem, ob es mit der linken oder rechten Hand geführt werden soll, auf einer Seite plan geschliffen ist (die andere Seite hat in aller Regel einen Hohlschliff). Die Pflege solcher Messer ist etwas aufwändiger (siehe hierzu Rudolph Krönungs hervorrangende Anleitung "Abenteuer Klingen Schärfen", die auf der Webseite des MKB heruntergeladen werden kann [1]), aber sie lohnt sich, da mit der langen, direkt über die Glasplatte geführten Klinge beste Schnitte gelingen, wenn diese gut geschliffen und frisch abgezogen ist.
Hier möchte ich aber näher auf den Schnitt mit handelsüblichen Einmalklingen eingehen, die in einem Messerhalter geführt werden. Die Klingen müssen nicht gepflegt werden und sind in 50er-Packungen im Laborfachhandel erhältlich (z.B. Leica 110143 - auf die breite Bauform achten). Der Klingenhalter wurde von den engagierten Mikroskopikern Hr. Herrmann, Hr. Kramer und Hr. Streble entworfen (SHK - Klingenhalter) und weiter entwickelt [2]. Er kann über Hr. Dr. Detlef Kramer (Kontakt über das Mikro-Forum von Christian Linkenheld) bezogen werden.
Es handelt sich dabei um zwei Aluminiumprofile, zwischen die die Einmalklinge mittels zweier Rändelschrauben geklemmt wird und durch deren Form der korrekte Schnittwinkel bereits fest vorgegeben ist. Am unteren Profil befindet sich ein Teflon-Gleiter, der eine saubere Führung über die Glasplatte des Zylindermikrotoms sicher stellt. Ein kleiner Nachteil soll dabei nicht verschwiegen werden: durch den Gleiter liegt der Schnitt mit dem Messerhalter um ca. 2 mm über der Glasplatte, was beim Schneiden freistehender Proben beachtet werden muss.

Auch flache Proben, wie das eingangs erwähnte Blatt, können so eingespannt werden. Dazu wird ein passender Möhrenblock, der den Zentralzylinder beinhalten sollte, einmal quer durchgeschnitten. Auch hier ist auf eine genau Senkrechte Schnittführung zu achten. Die beiden Hälften lässt man ein wenig antrocknen (vorbereiten!) und legt sie dann umgekehrt zusammen. Durch die unterschiedliche Verdunstung aus dem Zentralzylinder und dem umgebenden Speichergewebe der Möhre entsteht eine leichte Wölbung. Somit kann das Blatt optimal geklemmt werden, ohne es zu quetschen und auch nach vielen Schnitten wird es noch sicher gehalten.

Egal ob Spross oder Blatt: zum Abschluss der Vorbereitung und unmittelbar vor dem Einspannen in das Mikrotom wird die spätere Schnittfläche mit der Einmalklinge möglichst eben abgeschnitten, um später einen leichten Anschnitt zu ermöglichen.

Zur Umschließung der Probe kann in gleicher Weise auch Styrodur oder ein anderer Hartschaum aus dem Baumarkt verwendet werden. Bei der Verwendung eines Hartschaums leidet die Klinge jedoch, was zu kürzeren Standzeiten führt.
Eine bebilderte Anleitung der hier geschilderten Methode finden Sie auf dieser Seiten etwas weiter unten.

Rolf-Dieter Müller und Jörg Weiß vom 17.06.2011

Die Fürther Firma Haga Metallwarenfabrik bietet schon seit vielen Jahren unter der Marke Allmikro ein Rasierklingenmikrotom [1] an, das zu einem im Vergleich zu Schlitten- oder Rotationsmikrotomen günstigen Preis zu haben ist. Die damit minimal zu erreichende Schnittdicke ist mit 25 µm angegeben.

Im Vergleich zu einem klassischen Handzylindermikrotom, das mit der meist untauglichen "Messerbeigabe" deutlich günstiger ist und mit einem brauchbaren Klingenhalter [2] und passenden Einmalklingen (z.B. Leica Nr. 110143) die gleiche Preisregion erreicht, ergeben sich einige Vorteile, aber auch verschie- dene Einschränkungen.

Rolf-Dieter Müller und Jörg Weiß vom 17.06.2011

Die beliebte W3A-Färbung von Robin Wacker ("Wackerfärbung") scheint bisher nur von einem kleineren Kreis ambitionierter Mikroskopiker angenommen zu sein. Dies liegt sicher auch daran, dass sie als Dreifachfärbung nicht ganz einfach umzusetzen ist, zumal sie nur bei genauer Beachtung der Färbevorschrift zufriedenstellend ausfällt.

Sind die wunderbar differenziert gefärbten Pflanzenpräparate also nur zum Preise eines aufwändigen Färbeverfahrens zu haben?

Nein! Es geht einfacher, wenn man auf die kleinen virtuosen Tipps und Tricks zur Vervollkommnung verzichtet und sich nur auf ein Farbgemisch beschränkt, wie wir es von der Etzoldfärbung her kennen. Im folgenden werden die Farben der W3A-Färbung also in einer Simultanfärbung anwendet.

Zur Färbung frei schwimmender Schnitte wird die gewählte Farblösung zunächst 1:5 mit destilliertem Wasser (Aqua dest.) verdünnt.

Anschließend werden die Schnitte aus 70%igem Ethanol kommend nach stufenweiser Überführung in Aqua dest für 6 Minuten mit der gewählten und verdünnten Farblösung gefärbt. Dabei werden sie einmal kurz auf ca. 60 Grad erwärmt.
Das Erwärmen erfolgt am besten über einem Spiritusbrenner. Dabei wird das Uhrglas mit einer Holzklammer gehalten. Wenn die Lösung leicht zu dampfen beginnt, ist die richtige Temperatur erreicht. Auf keinen Fall dürfen Blasen entstehen.

Nach dem gut mit Aqua dest. ausgespült wurde, wird in reinem Isopropanol entwässert. Dabei ist auf eine ausreichend große Menge zu achten und mindestens dreimal zu wechseln, um eine schnelle Entwässerung sicher zu stellen und ein ungewolltes Ausspülen insbesondere des Acridinrots zu vermeiden.

Zum Schluss kann wie gewohnt in Euparal eingedeckt werden.

Die unterschiedlichen Reagenzien werden den im Uhrglas schwimmenden Schnitten mit einer feinen Pipette zugegeben und auch mit dieser wieder abgesaugt.  Dabei muss für die Entwässerung mit Isopropanol immer eine frische, trockene Pipette verwendet werden. Weitere Hinweise finden sie in der Färbeanleitung [4] in unserem Downloadbereich.

Hier kommen die Farblösungen unverdünnt zum Einsatz. Gearbeitet wird in den bekannten Färbeküvetten (hoher Reagenzienverbrauch) oder einzeln auf dem Objektträger über einer geeigneten Schale mit Auflage (umständlich bei einer größeren Anzahl Präparaten). Beschrieben ist hier die Behandlung einzelner Objektträger.

Zunächst muss das Paraffin entfernt werden. Dies geschieht durch Auftropfen von Xylol auf den aufgezogenen Schnitt. Dieses wird nach kurzer Einwirkzeit mindestens dreimal gewechselt, um das Paraffin restlos auszuspülen. Nach einer Zwischenspülung mit reinem Isopropanol wird auch hier stufenweise von Ethanol in Aqua dest. überführt (96%, 70%, 50%, 30% und Aqua dest.). Dabei und für das vorangegangene Isopropanol gilt: den Objektträger schräg stellen und mit dem jeweiligen Reagenz kurz abspülen, anschließend waagerecht legen und das Reagenz auftropfen und ca. 2 Minuten einwirken lassen.
Das Wasser im letzten Schritt mindestens 3 Minuten einwirken lassen und anschließend den Objektträger schräg gestellt gut abtropfen lassen. Dabei dürfen die aufgeklebten Schnitte keinesfalls austrocknen.

Jetzt kann gefärbt werden. Dazu wird die gewählte Farblösung (W3Asim I oder II) unverdünnt so aufgetropft, dass der gesamte Schnitt gut bedeckt ist. Die Einwirkzeit beträgt auch hier 5 Minuten, etwas längere Färbezeiten schaden nicht. Das Erwärmen entfällt, um den Schnitt nicht zu zerstören.

Am Ende der Färbezeit wird der Objektträger wieder schräg gestellt und die Färbelösung restlos mit Aqua dest. abgespült. Dann nochmals etwas Auqa dest. auftropfen und kurz einwirken lassen. Zum Entwässern wird das auf dem Schnitt stehende Wasser mit einer ausreichenden großen Menge reinem Isopropanol abgespült - dabei auch an die Rückseite denken! Dazu den Objektträger wieder schräg stellen. Nun wird reines Isopropanol aufgetropft und jeweils kurz einwirken lassen. Um sicher zu entwässern, sollte dieses mindestens dreimal gewechselt werden.

Mit einem sauberen, flusenfreien Tuch (ein Papiertaschentuch oder ein Kosmetiktuch geht auch) wird der Objektträger nun abgetrocknet. Dabei darf natürlich nicht über den Schnitt gewischt werden und auch hier ist wichtig, dass dieser nicht austrocknet.

Nach Auftropfen einer kleinen Menge Euparal kann das Deckglas aufgelegt werden und das Präparat ist fertig. Die Trockenzeit beträgt wie bei Euparal üblich sieben Tage, dann kann das Präparat senkrecht gestellt werden.

Die hier beschriebene Methode wurde im Rahmen des Monatstreffens des MKB vorgestellt und in der Praxis erprobt.

Der eigentliche Trick bei dieser Methode und der Unterschied zu den klassischen Rezepten ist, dass das Pflanzenmaterial trocken ist. Nur dann kann man sofort schneiden. Feuchtes Material müsste man 24h austrocknen lassen. Mike Guwak hat im Mikroskopieforum eine Methode beschrieben, bei der man das Pflanzenmaterial für 24h in eine 20% wässrige Lösung von Histowachs einlegt und das Wasser verdunsten lässt. Das verzögert die Bestimmung des Torfmooses um einen Tag. Er beschreibt aber sehr schön die Schnittechnik:

Dann beginnt das Schneiden unter dem Stereomikroskop. Den linken Zeigefinger legt man dazu auf das Objekt und schneidet dann mit der Rasierklinge entlang der Fingerkuppe einmal großzügig einen Streifen ab. Dann hat man eine gerade Schnittkante und von dort aus beginnt man. Wenn man jetzt den linken Zeigefinger ein wenig zurück nimmt oder die Rasierklinge etwas fester an die Fingerkuppe drückt, erhält man einen ersten Schnitt. Etwas Übung braucht man schon und mit der Zeit entwickelt sich ein motorisches Feingefühl, das zu hinreichend dünnen Schnitten führt. [3]

Nach dem Schneiden entfernt man die gröberen Histowachs-Partikel mit einer Pinzette und tropft nach Auflegen eines Deckglases Wasser auf die Schnitte. Das restliche Histowachs löst sich dann auf und das Deckglas verhindert oft, dass ggf. etwas zu dick geratene Schnitte auf die falsche Seite kippen.

Da die Torfmoosblättchen selbst kaum Eigenfärbung haben, muss man sie, besonders aber die Schnitte, kontrastieren. Speziell sind die bestimmungswichtigen Löcher (Poren) in den Zellwänden in ihrer Anordnung, Größe und Art sonst kaum sichtbar. Das kann mit optischen Methoden (Interferenzkontrast) geschehen, als auch einfacher durch Anfärbung. Geeignet sind alle Totalfärbungen, egal mit welcher Farbe.

Man kann daher Methylenblau verwenden (was zumeist empfohlen wird), aber auch Brillantkresylblau (BKB), Methylviolett, Eosin, Kernechtgrün u.a.

Eine preiswerte Alternative bieten selbst erstellte Totalfärbemittel. Dazu nimmt man leer geschriebene Kugelschreiberminen, zerschneidet diese in 2 cm lange Stücke, welche in eine Petrischale mit Ethanol oder Spiritus gelegt werden. Die restliche Minenfüllung löst sich dann und ergibt eine Farblösung, die abgegossen werden kann.

Die Farblösungen saugt man am besten unter das Deckglas, weil die dünnen Schnitte zu zart zum Umbetten sind. Noch einfacher ist die Verwendung eines Kopierstiftes. Man tunkt dazu die Minenspitze in den Wassertropfen mit den Schnitten, wobei sich der Minenfarbstoff löst und die Schnitte anfärbt.

Der geteilte Möhrenquader. Alle Schnitte sollten möglichst parallel zur Längstachse der Möhre und im rechten Winkel zueinander liegen. Dies erleichtert später die exakte Ausrichtung der Probe.

Der Anschnitt ist erfolgt, nun können Schnitte in der gewünschten Dicke erstellt werden. Die Klemmbacken aus der Möhre halten die Probe jederzeit sicher fest, ohne sie zu quetschen.

Die AcriBEN Färbung ist eine im Herbst 2009 entwickelte Färbung für botanische Schnitte [1], die auf den Farbstoffen Brillantkresylblau (BKB),  Acriflavin und Eosin beruht. Sie eignet sich besonders für die Färbung von dickeren Schnitten (> 15 µm) verholzter Gewebe, die nicht auf Objektträger aufgeklebt wurden. Mit Paraffinschnitten liegen noch keine Erfahrungen vor.
Die alte Färbevorschrift (siehe Foliensatz im Downloadbereich) sieht im letzten Schritt eine Färbung mit in Nelkenöl gelöstem Eosin vor. Dabei wirkt das Nelkenöl als Beize, die die Eosinfärbung verstärkt und stabilisiert.
Der große Nachteil dort ist die Eosin/Nelkenöl-Lösung, da sie für jeden Färbegang frisch angesetzt werden muss, das Ergebnis wegen der unsicheren Mischungsverhältnisse schwer steuerbar ist und immer die Gefahr besteht, dass sich Kristalle des ungelösten Eosins im Schnitt wieder finden.
Mit dem hier vorgestellten neuen Färbeprozess sollen diese Nachteile vermieden werden. Dies gelingt durch die Auftrennung von Färbung und Beizgang unter Anwendung einer Eosinlösung in reinem Isopropanol.

Ausgehend von Schnitten mit einer Dicke zwischen 15 und 60 µm, wie sie typisch beim Schneiden mit dem Handzylindermikrotom oder dem Schlittenmikrotom ohne Einbettung in PEG oder Paraffin anfallen, erfolgt die Färbung frei schwimmend in einem Uhrglas.
Die Schnitte werden zunächst in Ethanol 70% übernommen und stufenweise in destilliertes Wasser überführt. Dabei bleiben sie - wie auch bei allen folgenden Schritten - immer im gleichen Uhrglas. Die jeweiligen Reagenzien werden mit verschiedenen Einmalpipetten (0,5 ml) zugegeben und abgesaugt. Somit unterliegen alle Schnitte einer Charge den gleichen Färbezeiten und die Gefahr einer Beschädigung durch den Transport mit dem Pinsel ist minimiert (Uhrglasmethode nach Eckhard Völcker, Berlin).
Bei Bedarf kann gebleicht werden, was auch mit ca. 1:4 verdünntem Haushaltsreiniger (z.B. Klorix in der blauen Flasche) gut funktioniert. Beim Bleichen ist darauf zu achten, dass die Schnitte nicht zu lange in der Bleichlösung verbleiben, da sie sonst zerfallen (für Hölzer ca. 90 bis 120 Sekunden, krautige Proben entsprechend kürzer). Ausserdem muss das Bleichmittel sehr gut ausgespült werden, um die anschließenden Färbeschritte nicht zu beeinträchtigen. Hier empfiehlt sich mindestens fünfmaliges Spülen mit reichlich Aqua dest.

In der Vorfärbung werden die Schnitte hintereinander mit Brillantkresylblau und Acriflavin in wässriger Lösung gefärbt. Die Tests rund um den neuen Färbeprozess werden mit Sprossquerschnitten von der gemeinen Hasel (Corylus avellana) durchgeführt. Es handelt sich um Schnitte vom Zylindermikrotom mit einer Schnittdicke von 25 µm, die Leopold Aichinger dankenswerter Weise in größerer Anzahl zur Verfügung gestellt hat.
Die Färbezeit für das BKB liegt bei ca. 8 Minuten, für die anschließende Acriflavinfärbung reichen 20 Sekunden - dabei die Schnitte durch schwenken des Uhrglases etwas bewegen, um eine gleichmäßige Differenzierung zu erreichen. Das Acriflavin verdrängt das BKB sehr schnell aus den unverholzten Zellen. Zellen mit verstärkten Zellwänden zeigen sich nun in verschieden abgestuften Grüntönen.
Nach der Acriflavinfärbung gut spülen und anschließen ohne Zwischenstufe mit reinem Isopropanol (!) entwässern. Dazu das Wasser der letzten Spülung möglichst vollständig absaugen und eine größere Menge Isopropanol zugeben. Sofort wechseln und zwei mal wiederholen, beim dritten Absaugen eine frische Pipette verwenden. Anschließen noch zwei mal für ca. 3 Minuten in Isopropanol spülen, um die Restfeuchtigkeit vollständig zu verdrängen.

Im Gegensatz zum alten Färbeprozess erfolgt die Eosinfärbung nun nicht in einer Nelkenöl-Lösung, sondern in einer gesättigten Lösung von Eosin Y in reinem Isopropanol. Da diese Lösung nicht sehr lange haltbar ist, empfiehlt sich ein Ansatz von einer Spatelspitze Eosin in 5 bis 10 ml Isopropanol. Die Lösung muss nach dem Absetzen filtriert und dunkel gelagert werden.
Die so vorbereitete Farblösung kann nach dem Absaugen der letzten Isopropanol-Spülung vom Entwässern direkt auf die Schnitte gegeben werden. Abhängig von der Einwirkzeit und der zu färbenden Probe entfaltet sich eine mehr oder weniger intensive rote Färbung, die durch das anschließende Beizen in Nelkenöl noch verstärkt und stabilisiert wird.
Zum Beizen saugt man nach dem Ende der Färbezeit (empfohlen zwischen 5 und 10 Minuten) die Eosin/Isopropanol-Lösung gut ab, spült einmal mit reinem Isopropanol nach und tropft satt Nelkenöl auf. Die Schnitte verbleiben 5 bis 7 Minuten in der Beize. Alternativ können die Schnitte auch mit dem Pinsel in ein weiteres Uhrglas mit Nelkenöl überführt werden.
Am Ende der Beizzeit wird das Nelkenöl abgesaugt und mit Xylol ausgespült, auch hier mehrmals direkt hintereinander wechseln und eine frische Pipette verwenden. Im Anschluss daran werden die Schnitte noch für zwei mal mindestens 3 Minuten in frischem Xylol gespült und sind dann bereit zum Eindecken.

Hinweise zum Reaktionsholz in den Haselspross-Querschnitten finden Sie im Glossar.

Da zum Ausspülen des Nelkenöls Xylol verwendet wurde, kommt beim Eindecken der Präparate Malinol zum Einsatz. Beim Eindecken selbst sind keine Besonderheiten zu beachten. Eine Objektträgerschablone [2] hilft, den Schnitt in der Mitte des Objektträgers zu platzieren und das Deckglas zentriert aufzulegen.
Neben den Parametern des Färbeprozesses (Konzentration der Farblösungen und Einwirkzeiten, Bleichen, Beizen und Differenzieren) spielt auch das zu färbende Material eine Rolle, wenn es um die konkrete Wirkung einer bestimmten Färbung geht. Die AcriBEN-Färbungen sind am besten für stärker verholzte Proben geeignet, bieten aber auch bei krautigen Pflanzen schöne Ergebnisse. Dazu die folgenden Galerien mit Bildern vom Lavendel, Lorbeer, Phalaenopsis, Raps und Runzelblättrigen Schneeball, alle gemeinsam gefärbt nach AcriBEN8 (erste Galerie) und AcriBEN10 (zweite Galerie).

Letztes Jahr hatte ich mich intensiv mit der Wacker-Färbung beschäftigt. Aus den daraus resultierenden Internet-Veröffentlichungen entwickelte sich eine interessante Korrespondenz und in diesem Zusammenhang machte mich ein Mikroskopiker aus Belgien auf die Dujardin-Färbung aufmerksam.

Emmanuel P. Dujardin verwendet für seine Färbung Acridinrot, Chrysoidin und Astrablau. Hierbei wird mit Astrablau vorgefärbt und eine Nachfärbung erfolgt simultan mit einem Farbgemisch aus Acridinrot/Chrysoidin [1,2].

Was mich sehr überraschte: es ist eine zwischenzeitlich fast 50 Jahre alte Färbevorschrift die den neueren und derzeit beliebten Etzold- und Wackerfärbungen [3,4] in nichts nachsteht.

Die verholzten Zellwände werden äußerst differenziert in Farbtönen von Gelb bis Magenta angefärbt. Dagegen färbt Astrablau restliche Strukturen, besonders die unverholzten Zellwände, gleichmäßig bzw. in nur leicht abweichenden Farbnuancen an.

Jetzt wurde aber schon vor einigen Jahren vorgeschlagen, bei der Etzold-Färbung das Astrablau durch Alciangrün zu ersetzen, was statt des intensiven Blaus einen für die Betrachtung angenehmeren Grünton ergeben sollte [5]. Tatsächlich färbten aber verbreitete Chargen nur in einem unerklärlichen anderen Blau als Astrablau [6] und zwar solange, bis ein mikroskopierender Chemiker sich dieses Problems annahm und letztes Jahr die Rezeptur für Alciangrün neu entwickelte [7]. Dieses ist ihm so gut gelungen, dass nicht nur der Grünton sicher erreicht wird, sondern die Farblösung auch differenzierender färbt. Alciangrün ist ein Gemisch aus den chemisch verschiedenen Farbstoffen Alcianblau und Alciangelb. Die Ausprägung der Differenzierung bedarf aber noch einer näheren Untersuchung.

Das Alciangrün wird zwischenzeitlich sehr erfolgreich mit dem neuen Etzold Grün für botanische Färbungen eingesetzt.

Mit der Verfügbarkeit des neuen Alciangrüns ist es natürlich nahe liegend, dieses nicht nur bei der Etzold-Färbung zu verwenden, sondern es ebenso bei anderen Färbevorschriften statt des Astrablaus ersetzen. Hierfür muss aber gegebenenfalls, bedingt durch verschiedene chemische Eigenschaften, die Färbevorschrift in der Reihenfolge der zu verwendenden Farblösungen geändert werden.

Bei der von mir geschätzten Dujardin-Färbung reicht es, wenn man statt in der Reihenfolge Astrablau – Acridinrot/Chrysoidin einfach die Vorfärbung mit Acidinrot/Chrysoidin beginnt und mit Alciangrün nachfärbt. Hierbei ist aber eine Nachfärbung mit Chrysoidin vorteilhaft, wenn man die schönen Orange- bis Rottöne herausarbeiten möchte.

Die Verwendung von Alciangrün als Vorfärbung ist nicht möglich, denn nach meinen Erfahrungen wird es bei einer Nachfärbung mit Acridinrot/Chrysoidin wieder ausgezogen.

Im übrigen ist die bei sorgfältiger Entwässerung mit 100% Isopropylalkohol und nachfolgendem Einschluss in Euparal die bei Dujardin vorgeschriebene Differenzierung nicht erforderlich, tatsächlich sogar von Nachteil, denn das Chrysoidin wird durch Wasser verdünnten Alkohol ausgezogen, was besonders bei jüngerem Pflanzengewebe geschieht.

Im Ergebnis gleichartige Färbungen werden erreicht, wenn man die Dujardin-Färbung in Einzelfarblösungen als Dreifachfärbung ausführt. Hierfür hat sich bei mir die Reihenfolge Acridinrot, Alciangrün und Chrysoidin bewährt.

Für die Vorbereitung des nächsten Workshops in unserem Arbeitskreis Mikroskopie Bonn (Botanische Färbungen II) habe ich Blütenstängel Lavendel geschnitten und mit Dujardin-grün gefärbt. Beispielbilder finden Sie in der Galerie am Fuß des Artikels.

Zu allen hier erwähnten Färbungen sind die Rezepturen in den Originalarbeiten enthalten [1,3,4].

Einen Arbeitsplan für die Färbung mit Chrysoidin/Acridinrot/Alciangrün kann als PDF im Downloadbereich heruntergeladen werden.