Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und Acridinorange

Hoechst 33342 (Ho342) färbt DNA spezifisch. Acridinorange (AO) färbt ebenfalls DNA. AO ist für die DNA Färbung der Protisten jedoch kein zuverlässiger DNA-Farbstoff. Eine andere Eigenschaft macht Acridinorange jedoch wiederum sehr interessant in dieser Kombination, da es sich in sauren Organellen akkumuliert. So werden Lysosome, Acidosome (Paramecium) und Phagosome (Nahrungsvakuolen) in grünen, gelben oder roten Farben gefärbt. Die Farbe ist abhängig von der Konzentration und auch abhängig vom (sauren) pH-Wert. Acridinorange fluoresziert in seiner festen Form rot. Diese Farbe entsteht bei hoher Konzentration des protonisierten Acridinorange ebenfalls, da sich die protonisierten Farbstoffmoleküle bei hoher Konzentration aneinander lagern (Stapelbildung der Farbstoffmoleküle).

Benötigt werden ein Fluoreszenzmikroskop mit UV Anregung und geeignetem UV Filtersatz mit Anregungswellenlänge zwischen 360-390 nm, ein Langpassfilter für die Emission (sichtbares Spektrum ab 400-700 nm, blau bis rot), einstellbare Mikropipetten, Einwegpipettenspitzen, Eppendorfhütchen 1 ml für die Lösungen, geeignete Objektträger und Deckgläser und eine feuchte Kammer. Eine Farbkamera ist erforderlich, um die Ergebnisse entsprechend zu dokumentieren. Ausführliche Hinweise zu Filtersätzen und zur Farbfotografie finden sich im Originalartikel [1].

Gebrauchslösung: Die Farbstofflösung enhält beide Fluorochrome in einer Mixtur: Hoechst 33342 in Konzentration 27 μM und Acridinorange-Zinkchlorid in Konzentration 5 μM in sterilem Leitungswasser. Der Ansatz der Farbstoffe ist in der Originalveröffentlichung genauer beschrieben. Die Gebrauchslösung wird in einem Eppendorfhütchen dunkel gelagert (Zimmertemperatur) und ist mindestens 6 Monate verwendbar. Sind die Ergebnisse nicht mehr reproduzierbar, sollte man einen Neuansatz erstellen. 1 ml der Gebrauchslösung ist sehr ergiebig und reicht beim Befolgen der folgenden Anweisung zur Färbung für etwa 200 einzelne Präparate.

Sauberes und präzises Arbeiten sind das A und O wenn die Färbung gelingen soll. Objektträger und Deckgläser sind stets vorher zu reinigen und nur einmal zu verwenden. Objektträger, welche für die Fluoreszenz verwendet werden, sind vorher zu testen. Nicht alle Marken sind geeignet. Ich verwende aktuell Objektträger der Marke BMS sowie Deckgläser von Zeiss. Auf ungeeigneten und auch älteren Objektträgern werden nicht selten Niederschläge mit gefärbt. Soll mit Immersion beobachtet werden, ist ein Immersionsöl ohne Eigenfluoreszenz zu verwenden.

5 µl der Gebrauchslösung werden mit einer sauberen Einweg-Pipettenspitze auf einen Objektträger getropft. Hierauf werden 25 µl der Probe mit den Ciliaten getropft ohne die Pipette in den Farbstoff einzutauchen (Verdünnung typisch 1:5). Pipettenspitzen sind stets nur einmal zu verwenden, um gegenseitige Kontamination von Probe und Farbstoff zu vermeiden. Ich verwende stets zwei verschiedene Pipetten für Farbstoff und Probe. Wird eine neue Probe untersucht, dann ist eine neue Pipettenspitze zu verwenden. Hier besteht die Gefahr der wechselseitigen Kontamination der Proben mit fremden Ciliaten-Gemeinschaften. Enthält die Probe große Mengen an Bakterien oder Detritus, ist der Volumenteil des Farbstoffs ggf. zu erhöhen. Besser ist es die Ciliaten in diesem Fall zu vereinzeln und zu waschen, sofern sie dies vertragen.

Die mikroskopischen Präparate kommen nach dem Eindecken mit dem Deckglas in die feuchte Kammer. Die Färbedauer soll mindestens 3-4 Stunden oder über Nacht erfolgen.

Die Beobachtung erfolgt bei UV Anregung. Zur Anwendung kommen Filterwürfel mit Langpass Fluoreszenzfilter (Emission), die das gesamte Farbspektrum in der Emission zeigen. Die Anregungswellenlänge soll zwischen 360-390 nm liegen. Anregung mit LED ist bevorzugt.

Ich arbeite mit einem Zeiss AxioLab.A1 Fluoreszenzmikroskop (Weitfeld-Fluoreszenz) und einem Triple-Band-Filtersatz vom Typ F66-412 (Filterhersteller: Semrock), den man über die Firma AHF beziehen kann: http://www.ahf.de. Dieser Filter ist für die Anregung mit mehreren Wellenlängen konzipiert. Ich verwende ihn lediglich mit jeweils einer Anregungswellenlänge (hier: UV-LED mit Wellenlänge 385 nm). Der Filtersatz hat den Vorteil die intensive Autofluoreszenz von Chlorophyll zu unterdrücken, was bei der Beobachtung von Ciliaten mit Chlorellen oder gefressenen Algen wichtig ist.

Hoechst 33342 stellt den Zellkern in blauer Farbe dar (Macronuclei, Micronuclei) und erlaubt daher eine genauere Bestimmung. Acridinorange färbt saure Organellen in grünen bis roten Farbtönen. Falls der Zellkern von Acridinorange gefärbt erscheint (was selten der Fall ist), erscheint der Zellkern in einer blaugrünen Mischfarbe. Acridinorange färbt auch ciliäre Strukturen, Granula und gelegentlich auch Extrusome (z.B. bei Paramecium). Bei einigen Gattungen, etwa Paramecium oder Spirostomum, kann man sehr schön auch die Bildung von Nahrungsvakuolen erkennen. Bei einigen Arten sind saure Organellen oder Granula der Mundregion bis ins Innere zu verfolgen. Der Vorteil der Färbung liegt in der Lebendfärbung. Die Individuen können über Stunden und Tage studiert werden. Auch die zeitliche Dokumentation der Kernstrukturen während Teilung oder Konjugation ist möglich.

Dies ist ein seltener Wildfang von Paramecium caudatum aus einer der vielen Bornheimer Maare vom März 2019, und damit der wohl erste Nachweis dieser Art in dieser Region.
Die Färbung zeigt deutlich Macronuclei (Ma) und Micronucleus (Mi). Das hier abgebildete Individuum (Abb. 1, 2) trägt noch einen fragmentierten Macronucleus, nach vorheriger Konjugation, der erst nach weiterer Teilung wieder zu einem einzigen Macronucleus kondensiert. Am Ende der Mundhöhle sind saure Organellen zu erkennen, die ein sich bildendes Phagosom (Ph*) umschließen. Es handelt sich hierbei um Acidosome (Ac, erstmals beschreiben für Paramecium) bzw. Lysosome, welche Verdauungsenzyme zu dem sich bildenden Phagosom transportieren und dieses wie eine Hülle umschließen. Später wird das Phagosom abgeschnürt und wandert durch die Zelle, bis der verdaute Rest wieder ausgeschieden wird. Bild 2 zeigt Ausschnittsvergrößerungen dieses Phagosoms in verschiedenen Bildebenen. Die ersten beiden Aufnahmen lassen den Einlasskanal des Phagosoms erkennen (A,B). Nach oben wird die Kugelform sichtbar (C,D) bis hin zur oberen Decke (E). In diesen Ebenen (C-E) sind die einzelnen Acidosome erkennbar, welche die  die gebildete Vakuole umschließen und die Verdauungsenzyme bereitstellen.

Prorodon ovum:
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Spirostomum n.sp.:
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Paramecium caudatum:
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Spirostomum ambiguum:
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Stentor sp.:
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Pseudomonilicaryon sp.:
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